Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Các phương pháp phân tách và nhận diện các axit amin và peptit từ các hợp chất tự nhiên (Phần 1)

BioMedia

>> Các phương pháp phân tách và nhận diện các axit amin và peptit từ các hợp chất tự nhiên (phần 2)

  1. Giới thiệu

Các chất chiết xuất tự nhiên từ thực vật là nguồn cung quan trọng các hợp chất có hoạt tính sinh học mới có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Liệu pháp thực vật đặc biệt đang được phát triển hướng nghiên cứu quá trình phân lập những hợp chất có cấu trúc hóa học đặc thù – những hợp chất được xem là có hoạt tính dược học cao từ các loài cây thảo mộc. Các số liệu thống kê thường niên gần đây cho thấy có trên 1500 hợp chất mới được phát hiện trong các loài thực vật khác nhau, và có khoảng một phần tư trong tổng số thuốc kê theo đơn chứa các chất có nguồn gốc thực vật.

JorSld14

Có rất nhiều các loại hợp chất đã được tìm thấy trong rượu, các chất chiết xuất tự nhiên bao gồm: các amino acid, peptide, protein nhỏ, các phenol, chuỗi polyphenol, saponin, flavonoit, và các đường. Các hợp chất được đặc biệt quan tâm là các amino acid tự do và các peptide từ các chất chiết xuất này, có hoạt tính quan trọng ngăn chặn sự phát triển của các khối u.

Quá trình nhận diện cấu trúc của một sản phẩm tự nhiên liên quan đến việc xác định nhiều đặc tính lý – hóa như: nhiệt độ nóng chảy, độ quay quang, độ hòa tan, độ hấp thu, độ tán sắc quay quang học, độ phân cực lưỡng cực tròn, phổ hồng ngoại, cũng như phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Căn cứ trên các thông tin cơ bản như trên sẽ cho phép xác định một hoặc một số cấu trúc có khả năng tương thích với sản phẩm tự nhiên được nghiên cứu.

Các phương pháp phân tích cấu trúc phân tử hợp chất hữu cơ trước đây chỉ dựa trên một vài thông số lý hóa, như: nhiệt độ nóng chảy, độ hòa tan, phân tích nguyên tố, trọng lượng phân tử, và/ hoặc độ quay cực riêng, thì ngày nay các kỹ thuật hiện đại hơn, đặc biệt một loạt các kỹ thuật quang phổ trở thành những công cụ cực kỳ hữu hiệu trong việc phân tích và đặc tính hóa quá trình sàng lọc hóa học các hợp chất tự nhiên.

Hóa học các hợp chất tự nhiên gồm ba phần chính: phân lập, xác định cấu trúc, và các phương pháp tổng hợp. Phân lập được xem là một phần trong giai đoạn xác định cấu trúc phân tử, nên các phương pháp phân tích và xác định đặc tính, như phương pháp phổ UV-VIS và phổ hồng ngoại, phổ khối và các kỹ thuật sắc ký khác đều là những công cụ quan trọng trong việc xác định đúng các thành phần của một chất chiết xuất tự nhiên.

  1. Quá trình chuẩn bị mẫu

Bước cơ bản, đặc biệt cần thiết cho quá trình phân tách các axit amin và peptit, là việc xác định qui trình phân đoạn các chiết xuất phù hợp với các dung môi khác nhau để loại bỏ các hợp chất không mong muốn như polysaccarit, các lipid, phenol và các chất khác.

Điện di mao quản (CE) cho phép tách các axit amin mà không cần cơ chế tạo dẫn xuất. Bước tạo các dẫn xuất thường cần trong các kỹ thuật phát hiện quang học để làm tăng khả năng phát hiện. Một số tác nhân tạo dẫn xuất phổ biến: FMOC, NDA, OPA hoặc FITC.

Thông thường, trong các phân tích axit amin, các liên kết peptit phải bị phá vỡ trước tiên thành các axit amin độc lập. Trình tự và bản chất của các axit amin trong một protein hoặc peptit sẽ quyết định các đặc tính của phân tử.

Có nhiều phương pháp thủy phân được dùng trước khi phân tích axit amin, nhưng phổ biến nhất là phương pháp thủy phân axit. Tuy nhiên, phương pháp này có thể làm biến tính một số loại axit amin. Chẳng hạn, methionine và cystine sẽ bị phá hủy một phần hoặc bị oxy hóa thành axit cysteic và methionine sulphone. Cách tốt nhất trong trường hợp này là dùng dung dịch axit HCL nóng có thêm từ 0.1% đến 1% phenol để tránh quá trình halogen hóa của tyrosine.

Phương pháp thủy phân kiềm làm giới hạn các ứng dụng vì tác dụng phá hủy cấu trúc của các amino acid: arginine, serine, threonine, cysteine và cystine.

Phương pháp thủy phân enzym được cho là phương pháp tốt nhất cho qúa trình thủy phân hoàn toàn các liên kết peptit, vì nó không gây ảnh hưởng đến cấu trúc của các axit amin thiết yếu là tryptophan, glutamine và asparagines. Tuy nhiên, các ứng dụng của phương pháp này cũng bị hạn chế do những khó khăn thường gặp liên quan đến việc sử dụng các enzym.

Phân tách và xác định các thành phần hóa học của một hợp chất tự nhiên từ một thảo dược đòi hỏi một quy trình rất công phu. Ví dụ, đối với một loại thảo dược đa được biết đến như loài Chelidonium majus L, phải tiến hành chiết lần lượt trong các dung môi hexane, ethyl acetate, chloroform, và n-butyl alcohol. Mỗi dịch chiết thu được được phân tích chi tiết bằng các kỹ thuật sắc ký và quang phổ khác nhau.

Nghiên cứu khoa học gần đây đã phát triển một số kỹ thuật và cải tiến nhằm nhận biết các axit amin tự do, như việc định tính bằng quang phổ sử dụng các phương pháp so màu. Các thuốc thử thường được sử dụng như 2,4-dinitrofluorobenzene và genipin. Đồng thời, đề tài nghiên cứu khoa học cũng trình bày về kỹ thuật quang phổ hồng ngoại (viết tắt là IR) trong việc nghiên cứu các dịch chiết khác nhau của cây Angelica.

  1. Quang phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS)

Phổ UV-VIS của các hợp chất tự nhiên chứa thông tin về các đặc tính khác nhau (như: thành phần hóa học và cấu trúc phân tử). Những phương pháp như vậy tiến hành đơn giản, nhanh chóng, chi phí không cao, và an toàn; nên được sử dụng phổ biến.

Tuy nhiên, kỹ thuật này có một số nhược điểm, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: sự thay đổi chiều dài của chuỗi polypeptit, số lượng và các loại tồn dư axit amin, sự có mặt của các thuốc thử nhuộm màu, sự xuất hiện của các dung dịch đệm, các chất ổn định, và các loại tá dược khác, các yếu tố này có thể tác động trở lại với thuốc thử nhuộm màu hoặc bị hấp thụ ở bước sóng phát hiện.

  1. Quang phổ hồng ngoại (IR)

Nguyên lý hoạt động của quang phổ hồng ngoại IR dựa trên những dao động của phân tử, đại diện cho các liên kết hoặc nhóm liên kết hóa học đặc trưng. Hầu hết năng lượng dao động phân tử (dao động kéo, dao động xoắn, và dao động quay) tương ứng với các vùng hồng ngoại của quang phổ điện từ. Có nhiều kiểu dao động không đại diện cho một dao động liên kết đơn mà phụ thuộc rất nhiều vào các liên kết xung quanh và các nhóm chức. Một trong những ưu điểm lớn của phương pháp này cho các sản phẩm tự nhiên là có thể thu được phổ ở hầu hết các môi trường (dung dịch nước, dung môi hữu cơ, …) với lượng mẫu tương đối nhỏ.

Có rất nhiều các nghiên cứu khoa học về quang phổ IR liên quan tới cấu trúc của các axit amin và các peptit; một số đề tài tiếp cận tới các vấn đề như sau:

– Quang phổ hồng ngoại của các axid amin và peptit có gắn ion K+;

– Quang phổ hồng ngoại của các amin bị bớt đi một proton (H+) ;

– Quang phổ hồng ngoại của một số chất dẫn xuất của các axit amin, còn gọi là các amit (kết quả nghiên cứu đã chỉ ra sự xuất hiện của nhóm chức C=O trong vùng số sóng từ 1675-1680 cm-1 đối với hầu hết các hợp chất được nghiên cứu);

– Quang phổ IR của 5 axit amin tự nhiên: valine, proline, isoleucine, phenylalanine và leucine. Năm phổ đồ thu được tương tự nhau ở vị trí của nhóm C=O, và tần số hấp thụ của nhóm OH. Những khác biệt nhỏ xuất hiện chỉ trong trường hợp của dao động kéo của các nhóm C-H.

Từ đó có thể thu được các thông tin trong phổ IR của leucin (theo phổ đồ ở hình 1) như sau:

– Dải hấp thụ axit amin và peptit trong vùng sóng 3400 cm-1 là do lực kéo của các liên kết O-H và N-H.

– Các dải hấp thụ rộng trong vùng 3030-3130 cm-1 được cho là do những dao động hóa trị bất đối xứng của ion NH3+.

– Những dao động hấp thụ đối xứng trong vùng 2080-2140 cm-1 hoặc 2530-2760 cm-1, phụ thuộc vào các cấu trúc hóa học của các axit amin.

– Những dao động biến dạng nhóm amoni (NH3+) tại số sóng 1500-1600 cm-1, cùng với đặc tính hấp thụ của ion carboxyl.

– Các dải biến dạng bất đối xứng từ 1610-1660 cm-1 gắn liền với nhóm cacboxyl (COO), và nó biểu trưng cho sự hấp thụ yếu.

– Các dải trong vùng 1724-1754 cm-1 tương ứng với dao động của nhóm carbonyl (C=O).

image2

Hình 1. Phổ đồ FT-IR của leucine

Trong Hình 3 dưới đây, phổ đồ IR của dịch chiết Chelidonium majus L.:

image3

Hình 3: Phổ đồ IR của dịch chiết Chelidoniummajus L. (sau khi chiết xuất liên tục với các dung môi: hexane, ethyl acetate, chloroform và n-butul alcohol)

Các số sóng xuất hiện trên phổ đồ IR có thể do: OH (3405.67 cm-1), CH2 và CH(2975.62 cm-1), C=C (1644.02 cm-1), và C-O (1382.71    cm-1). Đồng thời, phổ UV-VIS của dịch chiết Chelidonium majus L. cho thấy sự tồn tại của 3 dải hấp thụ tương ứng ở các bước sóng: 734 nm, 268 m và 198 nm.

Để hoàn thiện việc nghiên cứu, có thể tiến hành các phương pháp phân tích sâu hơn (bao gồm cơ chế tạo dẫn xuất và HPLC).

 

(Còn tiếp…)

Nguồn: Peptide and Amino Acids Separation and Identification from Natural Products – Tác giả: Ion Neda1, Paulina Vlazan1, RalucaOana Pop1, Paula Sfarloaga1, Ioan Grozescu1 và Adina-Elena Segneanu DOI: 10.5772/51619

Sách: “Analytical Chemistry”, book edited by Ira S. Krull, ISBN 978-953-51-0837-5, Published: November 7, 2012

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam

Các bài viết cùng chủ đề

Các phương pháp phân tách và nhận diện các axit amin và peptit từ các hợp chất tự nhiên (Phần 1)

>> Các phương pháp phân tách và nhận diện các axit amin và peptit từ các hợp chất tự nhiên (phần 2) Giới thiệu Các chất...