Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Phần 1

BioMedia

Sắc ký cột là kỹ thuật phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm. Phương pháp này rất đơn giản và có thể phân lập các hợp chất khỏi hỗn hợp một cách nhanh chóng. Tuy nhiên, giống như nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để có thể thiết lập và chạy một cột sắc ký nhanh và hiệu quả lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm. Bài viết này có đề cập đến một số cách giúp bạn tối ưu hóa các thông số thí nghiệm để bạn có thể phân tách tốt nhất các hợp chất của mình.

Các cột sắc ký thường được dùng trong các phòng thí nghiệm vô cơ và hữu cơ để loại bỏ các nguyên liệu không phản ứng ban đầu hoặc phân lập một sản phẩm mong muốn khỏi các sản phẩm phụ sau khi phản ứng hoàn thành. Để làm được điều này, hỗn hợp phản ứng được đi qua một ống thủy tinh thẳng đứng, bên trong có nhồi hạt silica hoặc alumina, các chất đi ra được thu lại thành từng phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ ở đầu dưới của cột. Các thành phần khác nhau của mẫu được phân tách thành các loại hợp chất khác nhau do tương tác của hỗn hợp với silica.

Các hợp chất phân cực sẽ tương tác với silica mạnh hơn với các hợp chất không phân cực nên sẽ đi ra khỏi cột (hoặc rửa giải) sau các hợp chất không phân cực. Khi một mẫu có chưa các hợp chất có độ phân cực tương tự nhau, việc phân tách chúng ở các phần nhỏ và thu hồi mẫu sạch sẽ rất khó khan.

Việc nhồi cột chính xác được cho là yếu tố thực nghiệm quan trọng nhất, bên cạnh đó một số yếu tố khác có thể tối ưu để có thể đạt khả năng phân tách tốt nhất trong thời gian ngắn nhất. Sau đây là một số hướng dẫn lựa chọn dung môi và cách tính lượng silica nhồi cột cũng như kích thước cột phù hợp.

I/ Lựa chọn hệ dung môi

Đây là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất. Trong mỗi phòng thí nghiệm hóa hữu cơ có rất nhiều dung môi để lựa chọn.

Sắc ký cột, đặc biệt là sắc ký cột nhanh, thường tiến hành với một hỗn hợp 2 dung môi được dùng làm pha động: một dung môi phân cực và một dung môi không phân cực. Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp 3 dung môi khác nhau.

Nhiều người tự xây dựng được những hệ dung môi yêu thích và thường bắt đầu chạy với chúng, sau đó điều chỉnh tỷ lệ nếu cần.

Bảng 1: Hệ thống dung môi và hệ dung môi thường dùng trong sắc ký cột và sắc ký cột nhanh

Muốn phân tách sản phẩm và tạp chất tốt nhất và dùng tiết kiệm dung môi, bí quyết là kiểm tra hệ dung môi định sử dụng trước khi đưa lên cột sắc ký. Để làm được điều đó cần chạy mẫu trên sắc ký bản mỏng (TLC) – bản nhôm hoặc kính phủ silica (thường là bản nhôm vì rẻ hơn).

II. Phương pháp sắc ký bản mỏng:

Cần có:

Bản mỏng TLC

Kéo/dụng cụ cắt

Bút chì

Bình triển khai (bình thủy tinh) nhỏ như cốc có mỏ,

có thể quan sát được, có nắp đậy

Hệ dung môi muốn kiểm tra

Ống mao quản (Capilary) chấm bản mỏng TLC hoặc micropipette

(xem thêm: Cách chấm bản mỏng)

Kẹp gắp bản mỏng

Đèn UV hoặc Dụng cụ để phun thuốc thử KMnO4 để quan sát

Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.

Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.

Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro)  có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm.

Phương pháp thực hiện:

  1. Cắt bản mỏng thành các bản nhỏ kích thước khoảng 2 cm x 7 cm. Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105 – 110oC trong 30 phút. Ðể nguội rồi bảo quản trong bình hút ẩm. Khi dùng, nếu cần thì hoạt hóa lại bằng cách sấy ở 105-1100C trong 1 giờ rồi cạo bỏ một dải mỏng chất hấp phụ dọc hai bên cạnh của tấm kính.
  2. Kẻ một đường bút chì ở mặt phủ silica, cách cạnh đáy khoảng 0.5cm. Không sử dụng bút mực, vì mực sẽ hòa tan trong dung môi hữu cơ và tách ra, che lấp hoặc làm nhiễu kết quả.
  3. Đổ (hệ) dung môi muốn kiểm tra vào trong bình triển khai. Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 – 25oC. Dung môi phải ngập khoảng 2-3 mm, không để điểm chấm mẫu và vạch chìm trong dung môi. Điều này đảm bảo việc mẫu không bị hòa tan vào dung môi và sẽ chạy trên bản mỏng cùng với dung môi.
  4. Sử dụng ống mao quản hoặc micropipette để chấm mẫu: chấm mẫu rồi chấm nhẹ lên bản mỏng và chỉ đủ để mẫu từ ống mao quản chuyển sang bản mỏng. Tốt nhất là chấm khoảng 2-3 lần với lượng nhỏ, thời gian mỗi lần >1 giây để giữ mẫu ở trên bản mỏng lâu hơn. Đường kính điểm chấm mẫu khoảng 1-2mm. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp.

Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg). Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 – 50 mg ở dạng dung dịch. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm

5. Đặt bản mỏng thẳng đứng trong bình triển khai đã chưa dung môi.

6. Đợi và kiểm tra thường xuyên. Không làm dịch chuyển hay chạm vào bản hoặc bình triển khai vì có thể gây ra những dao động trong dung môi và làm cho thay đổi quá trình dung môi chạy lên bản mỏng

7. Khi dung môi chạy còn cách đỉnh bản mỏng từ 0.5 – 1cm, cẩn thận nhấc bản mỏng ra khỏi bình triển khai bằng kẹp.

8. Để các dung môi trên bản mỏng bay hơi, sau đó soi bản mỏng dưới đèn UV hoặc phun thuốc thử KMnO4

9. Dùng bút chì đánh dấu các vị trí đốm có màu mạnh (khi dùng KMnO4), để tránh việc chúng bị mất mầu dần theo thời gian từ đó khó có thể đo được giá trị Rf của nó dưới đèn UV

Bây giờ có thể xác định xem liệu các thành phần của mẫu đã tách trong dung môi lựa chọn chưa. Nếu kết quả phân tách kém, sử dụng hệ dung môi khác và thử lại lần nữa.

III/ Thế nào là phân tách tốt? Từ sắc ký bản mỏng TLC sẽ thu được gì?

Kết quả cuối cùng sẽ là hệ dung môi tách được hợp chất mong muốn với tỷ lệ khoảng 1/3 đường đi của dung môi (giá trị Rf trong khoảng 0.25 – 0.35, Hình 1)

Hình 1.  Hình ảnh trên bản mỏng TLC điển hình và cách xác định giá trị Rf.

Một hệ dung môi cho giá trị Rf trong khoảng 0.25 - 0.35 là dung môi tách khá tốt có thể đưa lên cột và có thể tách được cấu tử mong muốn. Không nên tìm kiếm dung môi có giá trị Rf cao hơn – đặc biệt nếu bạn chỉ kiểm tra hệ một dung môi – làm chất rửa giải vì nó có thể tạo thành tạp chất dưới dạng một vết chấm khác (hình 2).

Hình 2. Lựa chọn giữa dung môi rửa giải nhanh (trái) và dung môi làm mất vết tạp chất (phải).

Mặc dù có thể có chấm cho giá trị Rf rất cao, nhưng ngược lại nếu hợp chất mong muốn là một trong các vết chấm rửa giải ra sau. Điều này hoàn toàn có thể với các chấm đi lên rất chậm (Rf thấp). Hình 3 cho thấy chấm sản phẩm mong muốn mới tách rời vạch xuất phát thì tạp chất đã đi rất xa. Có thể bạn sẽ lựa chọn dung môi này để tránh nguy cơ tạp chất gây ra phân tách kém và có giá trị Rf cao hơn. Điều này được chứng minh thường không đúng. Các hợp chất nằm trên cột càng lâu, thì chúng càng dễ bị phân hủy và thu hồi được càng ít sản phẩm. Cố gắng phân tách một chất có giá trị Rf thấp cũng mất nhiều thời gian và tốn dung môi. Trong trường hợp này, tốt hơn là cố gắng phân tách hỗn hợp và sử dụng nhiều bản mỏng hơn (xem thêm ở dưới).

Hình 3. So sánh giữa dung môi phân tách rõ (bên trái) và dung môi rửa giải nhanh (bên phải) trong trường hợp sản phẩm là vết chấm thứ 2.

Khi bạn tìm thấy một hệ dung môi phân tách phù hợp, bạn cũng cần xem lại hình dạng của vết sau khi chạy bản mỏng. Nếu lý tưởng, các vết này sẽ có hình tròn và xa các vết khác (Hình 4, vị trí 1). Các vết với đuôi dài trên bản mỏng có thể do dải rộng và có khả năng các hợp chất bị chồng lên nhau nếu chạy trên cột. Nếu bạn cố thử một số hệ dung môi khác và vẫn không tìm được hệ cho các chấm tròn đẹp thì cũng không cần lo lắng. Miễn là việc phân tách các vết tốt thì khi đưa lên cột nó cũng tách tốt (Hình 4, vị trí 2). Trong vị trí 3 của hình 4, vẫn có thể thu được mẫu sạch của hợp chất trên cùng, nhưng đương nhiên bạn sẽ bị mất bớt đi một lượng sản phẩm vì đuôi của nó bị dinh vào dải sản phẩm tiếp theo trên cột. Vì vậy có thể sử dụng khi không quan tâm lắm đến việc thu hồi sản phẩm.

Hình 4. Các  khả năng có thể xảy ra trên bản mỏng TLC.

IV/ Một số yếu tố khác cần xem xét khi lựa chọn hệ dung môi

Đôi khi bạn sẽ gặp trường hợp có 2, hoặc nhiều hệ dung môi đều cho phân tách tốt hoặc có trường hợp dung môi được lựa chọn lại là dung môi không cho tách tốt nhất. Vậy điều gì khác ảnh hưởng tới lựa chọn của bạn?

Có 2 yếu tố khác cần xem xét đến: giá thành và điểm sôi.

Giá thành

Nếu 2 hệ dung môi cho hiệu quả phân tách tương đương nhau, đương nhiên nên lựa chọn dung môi không bị halogen hóa và rẻ hơn. Điển hình là hỗn hợp dung môi hexan:etyl axetat. Nếu bạn không chắc chắn về giá thành tương đối của dung môi, cách tốt nhất là so sánh về kích thước của bình chứa. Thông thường dung môi rẻ hơn sẽ được bán với đóng gói lớn hơn so với dung môi đắt tiền khác.

Điều đáng chú ý là một số dung môi rẻ như hexan hay ete dầu hỏa đặc biệt đựng trong các chai/bình nhựa, thường chứa hydrocacbon bão hòa, rất khó tách và có thể gây khó khan cho việc giải phổ NMR, nhất là trong dải 1 – 1.5ppm. Trong trường hợp này, dung môi cần được cất loại trước khi sử dụng (tốn thời gian) hoặc có thể sử dụng dung môi tốt hơn (đắt tiền hơn).

Điểm sôi

Lập luận để lựa chọn 2 hệ dung môi có hiệu quả tách tương đương nhau nhưng có nhiệt độ khác xa nhau khá đơn giản: thường lựa chọn dung môi có nhiệt độ sôi thấp hơn. Bạn sẽ tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức khi phải tiến hành thí nghiệm lâu vì dung môi có nhiệt độ sôi cao hơn sẽ tốn thời gian để bay hơi hơn và cần nhiệt cao hơn hay áp suất thấp hơn để loại bỏ, khi bạn cố gắng thu hồi lại sản phẩm của bạn từ dung môi.

V/ Lựa chọn chính xác kích thước cột

Một số người sẽ cho rằng đây là yếu tố không quan trọng trong việc lựa chọn cột. Thật vậy, về mặt lý thuyết có thể dùng cột rất nhỏ rất dài chưa silica hoặc cột lớn với chiều dài ngắn hơn đều cho hiệu quả như nhau (Hình 5).

Hình 5. Lựa chọn kích thước cột không quan trọng bằng việc tính toán lượng silica sử dụng.

Tuy nhiên, trên thực tế, hầu hết người sử dụng chọn cột có kích thước cho phép họ đô lượng silica cần thiết từ 1/3 tới ½ cột – không bao gồm chỗ chưa dung môi (Hình 6). Điều này, đương nhiên phụ thuộc vào lượng silica mà bạn sử dụng.

Hình 6. Hướng dẫn chọn đường kính cột sơ bộ

VI/ Lượng silica cần thiết là bao nhiêu?

Lượng silica bạn cần được xác định bằng lượng mẫu mà bạn cần tách. Tỷ lệ silica/mẫu không cần phải chính xác, nhưng cần đúng tương đối để không làm lãng phái thời gian và mẫu, dung môi. Có thể cân silica hơn là đo về thể tích, vì tỷ trọng silica có thể thay đổi tùy loại.

Một yếu tố khác ảnh hưởng tới lượng silica yêu cầu là việc tách hỗn hợp dễ hay khó. Điều này được xác định khi chạy sắc ký bản mỏng. Việc phân tách càng khó thì tỷ lệ lượng silica so với mẫu càng lớn.

Bảng 2. Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên bản mỏng.


VII/ Vậy còn yếu tố nào ảnh hưởng tới sắc ký cột?

Một khi bạn đã chọn được hệ dung môi phân tách, tính được lượng silica bạn cần và tìm ra được cột phù hợp, khi đó bước tiếp theo của bạn là nhồi cột (phần 2). Đương nhiên, mỗi cột không phải lúc nào cũng cho kết quả tách lý tưởng như lý thuyết. Trong bài tiếp theo chúng ta sẽ xem xét đến việc giải quyết các vấn đề thường gặp và cách để xử lý khi chạy sắc ký cột (phần 3).

Tác giả: Sarah Millar

Nguồn: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim /www.chemistryviews.org 

Dịch và biên tập BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Phần 1

Sắc ký cột là kỹ thuật phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm. Phương pháp này rất đơn giản và có thể phân lập...