Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Sắc ký: Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC (phần 1)

BioMedia

Xem thêm >>> Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 2

Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 1

Cột sắc ký được xem là phần quan trọng nhất của một thiết bị sắc ký, nơi xảy ra quá trình tách chất. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại cột HPLC và việc tìm ra loại cột chính xác phù hợp cho ứng dụng của bạn dường như là một thử thách khó khăn. Để lựa chọn được loại cột phù hợp nhất, người mua cần cân nhắc nhiều yếu tố khác nhau. Dưới đây là một vài yếu tố chính cần xem xét khi chọn mua cột HPLC.

LE-Guide to HPLC columns-700x200-07172013

Nguồn: www.merckmillipore.com

  1. Về ứng dụng

Trước tiên người mua cần xác định khối lượng nguyên tử của chất cần phân tích. Thông thường các hợp chất được chia làm 2 loại: loại có khối lượng phân tử nhỏ (<5000 Dalton) và loại có khối lượng phân tử lớn (>5000 dalton). Sau đó người mua cũng cần xem chất cần phân tích tan trong nước (chất phân cực) hay tan trong dung môi hữu cơ (không phân cực). Cuối cùng, cân nhắc phương pháp tách sẽ giúp người mua thu hẹp lại phạm vi lựa chọn loại cột cho mình.

Bảng 1: Lựa chọn phương pháp tách

Khối lượng phân tử

Tính tan

Kích thước cột

Khối lượng phân tử nhỏ

 

(<5000g/mol)

Tan trong nước
  • Trao đổi ion
  • Pha đảo
  • Sắc ký tương tác ưa nước
Tan trong dung môi hữu cơ
  • Pha thuận
  • Pha đảo
  • Sắc ký rây phân tử không sử dụng nước
Khối lượng phân tử lớn

 

(>5000g/mol)

Tan trong nước
  • Sắc ký rây phân tử sử dụng nước
  • Trao đổi Ion
  • Tương tác kỵ nước
  • Pha đảo
Tan trong dung môi hữu cơ
  • Sắc ký rây phân tử không sử dụng nước

Có rất nhiều cột khác nhau trên thị trường đã được thiết kế cho các ứng dụng cụ thể, chẳng hạn như phân tích đối xứng; đồng phân đối hình (đối quang); Vitamin; Thuốc trừ sâu; Carbohydrates. Để tối ưu hóa phương pháp bạn nên chọn các loại cột này.

  1. Về pha tĩnh

Sau khi đã xác định được các ứng dụng của mình, bước tiếp theo người mua cần xác định loại pha tĩnh. Các yếu tố cần cân nhắc gồm tính chất hóa học của cột, phương pháp tách, kích cỡ hạt và khả năng lưu.

2.1 Tính chất hóa học của cột

Cột thường được nhồi đầy các hạt xốp, rỗng và được bao phủ một lớp các chất có tương tác với mẫu được bơm vào. Chất phân tích sẽ được các hạt nhồi giữ lại.

Có nhiều cách khác nhau để phân loại pha tĩnh tuy nhiên cách phân loại rộng rãi nhất được chấp nhận hiện nay là theo hệ thống USP “L” (Dược điển Hoa Kỳ). Theo tiêu chí này, có trên 60 loại cột dựa theo loại pha liên kết (C18, C8…), loại hạt nhồi và kích cỡ hạt.

Bảng 2: Phân loại một số loại cột phổ biến theo dược điển USP “L”

USP Pha tĩnh Chi tiết
L1 C18 – Octadecyl silane Octadecyl silane liên kết với silicagel xốp kích thước hạt 1.5-10 μm
L7 C8 – Octyl silane Octyl silane liên kết với silicagel xốp toàn phần kích thước hạt, 1.5-10 μm
L8 NH2 – Aminopropyl silane Aminopropyl silane liên kết với silicagel xốp toàn phần kích thước hạt 3-10 μm
L10 CN – nhóm Nitrile Nhóm Nitrile liên kết với silicagel xốp kích thước hạt 3-10 μm
L11 Phenyl Nhóm Phenyl liên kết với silicagel xốp kích thước hạt 1.5-10 μm
L43 PFP – Pentafluorophenyl Nhóm PFP liên kết với silicagel xốp kích thước hạt 5-10 μm

Cột monolith gồm một trục có chứa silicagel (hình que) có độ tinh sạch cao với các rãnh xốp thay vì loại cột nhồi thông thường. Cột monolith có thể sử dụng với các hệ thống HPLC hiện tại cho phép phát triển phương pháp tối giản và cho phép rửa giải nhanh hơn.

2.2 Cân nhắc phương pháp tách

Phương pháp tách chủ yếu dựa vào 3 đặc tính cơ bản của hợp chất hóa học nhồi cột: độ phân cực, độ tích điện và kích thước phân tử

2.2.1 Phương pháp tách dựa trên độ phân cực

Có hai phương pháp tách phổ biến nhất dựa trên độ phân cực của một chất: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo (phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi và pha tĩnh). Ngoài ra trong những năm gần gây Sắc ký tương tác ưa nước (HILIC) và Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC) ngày càng được sử dụng rộng rãi đặc biệt trong việc tách các hợp chất phân cực và các phân tử sinh học lớn.

HPLC pha thuận (pha thường):

Sắc ký pha thuận (NP) sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực. Chất phân tích được giữ lại dựa vào tương tác giữa các nhóm chức phân cực của nó với các nhóm phân cực trên bề mặt vật liệu nhồi.Chất phân tích được tách ra theo thứ tự chất kém phân cực nhất tới chất phân cực nhất. Ứng dụng:thường được dùng trong việc tách các chất có độ phân cực thấp tới trung bình và có khả năng tan tốt trong dung môi có độ phân cực nhỏ. Các chân phân tích tan trong nước thường không dùng phương pháp này.

HPLC pha đảo:

Trong sắc ký pha đảo (RP), pha tĩnh bị biến đổi thành không phân cực bằng cách gắn thêm các nhánh hydrocarbon dài lên bề mặt chất nhồi. Thông thường các hydrocarbon này sẽ là các chuỗi alkyl kỵ nước với độ dài 4, 8 hoặc 18 phân tử cacbon. Tên của cột thường được đặt theo số lượng các phân tử cacbon ví dụ C4, C8, C18. Ứng dụng: Cột C4 thường được sử dụng để tách các protein trong khi cột C8 và C18 hay được sử dụng để tách các peptit hoặc các phân tử nhỏ.

Sắc ký tương tác ưa nước (HILIC):

Cơ chế chính của HILIC là phân tách lỏng-lỏng giữa pha động phân cực và lớp nước trên bề mặt pha tĩnh. Pha tĩnh phân cực (như silica và amine) và pha động (có thể là nước và methanol) được sử dụng và việc tăng độ phân cực của pha động sẽ làm giảm khả năng lưu giữ chất phân tích. Điều này rất có lợi trong việc phân tách các hợp chất có độ phân cực cao, những chất không giữ lại được nếu sử dụng sắc ký pha đảo. Ứng dụng chủ yếu của kỹ thuật này là phân tích Amino axit, các loại thuốc phân cực, alkaloid, carbohydrate, nucleobase và nucleoside.

Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC):

HIC là một loại sắc ký pha đảo và thường được sử dụng để tách các phân tử sinh học cỡ lớn ví dụ như protein. Phương pháp này giúp giữ các phân tử chất phân tích nằm nguyên trong dung dịch nước, tránh tiếp xúc với dung môi hữu cơ có thể gây phân hủy chúng. Việc tăng lực hấp dẫn kỵ nước (bằng cách cho thêm muối bão hòa) làm cho bề mặt khu vực kỵ nước của protein bị hấp phụ và dính với khu vực kị nước trên bề mặt chất nhồi. Ngược lại, việc làm yếu tương tác kỵ nước (bằng cách giảm nồng độ muối) sẽ làm các chất phân tích tách khỏi bề mặt chất nhồi (giải hấp).

(Còn tiếp)

Nguồn: SelectScience.net

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam

Các bài viết cùng chủ đề

Sắc ký: Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC (phần 1)

Xem thêm >>> Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 2 Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 1 Cột...