Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm GLP với máy HPLC - Phần 2

BioMedia

Hệ thống an toàn chất lượng phòng thí nghiệm GLP (Good Laboratory Practice ) là tất cả các hoạt động có hệ thống được hoạch định sẵn và áp dụng theo hệ thống chất lượng, thể hiện những yếu tố thích hợp nhằm đảm bảo độ tin cậy cần thiết đáp ứng được các yêu cầu chất lượng. Bài viết chỉ dẫn một số thao tác đáp ứng GLP cho các phòng kiểm nghiệm đối với máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

III. Thay đổi dung môi

3.1. Từ pha đệm sang pha rửa hay pha bảo quản

Cần đảm bảo rằng dung dịch đệm hòa tan trong pha lưu trữ hoặc pha rửa. Đầu tiên, rửa toàn bộ hệ thống bằng một hỗn hợp dung môi chứa nhiều nước để  loại bỏ dung dịch đệm trong hệ thống và cột, sau đó đổi từ pha rửa này bằng một hỗn hợp dung môi để bảo quản hệ thống.

3.2. Từ pha thường sang pha đảo và ngược lại

Một số loại cột (ví dụ Hypercarb™) có thể được sử dụng trong cả pha thường và pha đảo và đương nhiên là cả 2 loại dung môi tương ứng.

Để chuyển từ cột/hệ sắc ký pha thướng sang cột/hệ sắc ký pha đảo, sục dung môi có thể trộn lẫn vừa với dung môi pha thường đang sử dụng vừa với dung môi pha đảo định sử dụng. Nếu dung môi pha đảo cuối cùng có cả dung dịch đệm, nên chuyển từ dung môi 100% methanol sang thành bằng dung môi 50% methanol

Ví dụ:

Pha thường        : Hexan/Etyl axetat

Rửa                        : IPA (isopropenyl axetate) sau đó methanol – cuối cùng dung dịch Metanol/Nước (50/50)

Pha đảo                : dung môi methanol có đệm nước

Để chuyển từ cột/hệ sắc ký pha đảo sang cột/hệ sắc ký pha thường, cũng tuân thủ các bước tương tự như trên nhưng theo thứ tự ngược lại…

Ví dụ:

Pha đảo                : dung môi methanol có đệm nước

Rửa                        : Metanol/Nước (50/50)  sau đó methanol – cuối cùng dung dịch IPA (isopropenyl axetate)

Pha thường        : Hexan/Etyl axetat

3.3. Nói chung

Trước khi có bất kỳ thay đổi dung môi nào, cần đảm bảo hệ đã có sẵn dung môi cũng như cột sắc ký phải tương thích với loại dung môi mới.

Nếu chưa biết về khả năng trộn lẫn và tính chất vật lý của dung môi cũ và dung môi định thay thế, tốt nhất nên thử trước bên ngoài (vào cốc thủy tinh) rồi mới bơm dung môi mới lên máy, việc xử lý vấn đề về trộn lẫn sẽ dễ hơn trước khi đưa lên máy.

3.4. Khả năng trộn lẫn của các dung môi

Các ô màu xanh: có thể trộn lẫn – các hỗn hợp dung môi theo một số tỷ lệ nhất định có thể tách thành 2 pha

IV. Các đặc tính của dung môi

Bảng sau đây liệt kê một loạt các dung môi phổ biến dùng trong HPLC và những tính chất vật lý tiêu biểu nhất bao gồm độ nhớt và hệ số trộn - miscibility number.

Hệ số trộn là thông số có thể dùng để dự đoán khả năng trộn lẫn của các dung môi.

- Nếu hiệu số của hệ số trộn của 2 dung môi ≤ 15 thì 2 dung môi này có thể hòa tan trong mọi tỷ lệ ở nhiệt độ 15ºC.

- Nếu hiệu số của hệ số trộn của 2 dung môi là 16 thì 2 dung môi này có thể hòa tan tới hạn trong khoảng nhiệt độ từ 25-75ºC, và tối ưu ở 50ºC.

- Nếu hiệu số của hệ số trộn của 2 dung môi ≥ 17 thì 2 dung môi không trộn lẫn vào nhau và nhiệt độ tới hạn của chúng là trên 75ºC.

*: đề cập tới dung dịch 1% trong nước

Các dung môi có hệ số trộn lẫn gấp đôi nhau không thể trộn lẫn với các dung môi rất ưa béo khác. Trị số thấp hơn là dung môi ưa béo cao và trị số hòa tan cao hơn là dung môi ít ưa béo hơn.

Các dung môi có trị số trộn lẫn gấp đôi nhau trong một số trường hợp không tan lẫn vào nhau.

V. Các đặc tính của dung dịch đệm

Bảng dưới đây liệt kê một loạt các dung dịch đệm dùng trong HPLC, các tên gọi khác, giá trị pKa (hằng số phân ly axit) tại 20ºC.

Độ truyền qua của dung dịch buffer thay đổi nên cần được đo trước khi sử dụng vì nó sẽ thay đổi theo nồng độ muối.

Việc lựa chọn buffer phụ thuộc nhiều vào chất phân tích và thiết bị sử dụng. Về mặt lý thuyết, các ứng dụng của máy LC/MS cần các loại buffer dễ bay hơi vì nó sẽ không tạo cặn ở trong côn và nguồn (của máy khối phổ). Cần tránh các axit vô cơ, buffer không bay hơi, tác nhân cặp điện tử.

Các buffer cho máy LC/MS thường dùng bao gồm:

• ammonium acetate/formate/hydrogen carbonate (< 50 nM)

• formic/acetic acid (0.01 – 1% v/v)

• trifluoroacetic acid (< 0.1% v/v)

• trialkylamine and aqueous ammonia type bases

• TRIS (tri-hydroxyméthyl-amino méthane)

• BIS-TRIS propane

Các chất điện giải thường được thêm vào dung dịch đệm của máy LCMS để cái thiện tín hiệu peak (đỉnh sắc ký). Các chất này tốt nhất có thể bay hơi. Cần chú ý lựa chọn dung dịch đệm buffer và hỗn hợp thêm vào để đảm bảo dung dịch tạo bởi những chất này không tạo thành muối rắn gây nhiễu hệ thống.

Dung dịch đệm luôn phải được rửa giải khỏi cột phân tích và thiết bị sau khi sử dụng để tránh các muối bị đóng cặn trên các bộ phận của thiết bị.

Trong sắc ký HPLC pha đảo, chất phân tích được lưu lại có liên quan tới tính ưa nước của chúng. Chất phân tích càng ưa nước thì thời gian lưu càng lâu. Khi chất phân tích bị ion hóa, nó trở nên ít ưa nước hơn và do đó bị rửa giải.

Khi phân tách hỗn hợp có chứa các axit và/hoặc các ba zơ bằng sắc ký pha đảo, cần kiểm soát độ pH của pha động bằng dung dịch đệm phù hợp để thu được kết quả có độ lặp lại cao.

Khi axit mất đi 1 proton (H+) trở thành ion âm (độ pH tăng lên), thời gian lưu bị giảm đi

Khi ba zơ nhận 1 proton (H+) trở thành ion dương (độ pH giảm đi), thời gian lưu tăng lên

(Còn tiếp)

Nguồn: Université de neuchâtel

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam

Các bài viết cùng chủ đề

Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm GLP với máy HPLC - Phần 2

Hệ thống an toàn chất lượng phòng thí nghiệm GLP (Good Laboratory Practice ) là tất cả các hoạt động có hệ thống được hoạch...