BioMedia

Hệ thống an toàn chất lượng phòng thí nghiệm GLP (Good Laboratory Practice ) là tất cả các hoạt động có hệ thống được hoạch định sẵn và áp dụng theo hệ thống chất lượng, thể hiện những yếu tố thích hợp nhằm đảm bảo độ tin cậy cần thiết đáp ứng được các yêu cầu chất lượng. Bài viết chỉ dẫn một số thao tác đáp ứng GLP cho các phòng kiểm nghiệm đối với máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

VI. Bước sóng phát hiện các chất mang màu

Nhóm mang màu là các nhóm hấp thụ ánh sáng. Tính chất này được dùng để phát hiện chất phân tích, chúng có một hay nhiều bước sóng phát hiện, mỗi bước sóng này gắn với một phân tử hấp thụ nhất định. Các thông tin trong bảng dưới đây tuy chưa đầy đủ nhưng có thể cung cấp một số thông tin về các nhóm  mang mầu này

VII. Làm sạch và tái sử dụng cột sắc ký

Trong mọi trường hợp, lượng dung môi sử dụng khoảng 40-60% so với tổng kích thước cột (trừ khi có các yêu cầu khác).

Hiệu suất, hiệu quả của cột… có thể được đo ở điểm đầu và cuối của quá trình làm sạch để bảo đảm hiệu quả làm việc cũng như cải thiện được hiệu quả tách.

Cần đảm bảo không còn mẫu hay dung dịch đệm trong cột và dung môi được dùng  trước đó với dung môi rửa cột phải trộn lẫn.

Sau khi làm sạch, phải kiểm tra lại sự tương thích giữa pha động và dung môi cuối cùng trên cột.

7.1. Môi trường pha thường

1. Rửa với tetrahydrofuran
2. Rửa với methanol
3. Rửa với tetrahydrofuran
4. Rửa với metylen chloride
5. Rửa với n-hexan không chứa benzen

7.2. Môi trường pha đảo

1. Rửa với nước loại HPLC grade; tiêm thêm 4 lần 200µl dung dịch DMSO trong suốt quá trình này
2. Rửa với methanol
3. Rửa với chloroform
4. Rửa với methanol

7.3. Môi trường trao đổi ion âm

1. Rửa với nước loại HPLC grade
2. Rửa với methanol
3. Rửa với chloroform

7.4. Môi trường trao đổi ion dương

1. Rửa với nước loại HPLC grade; tiêm thêm 4 lần 200µl dung dịch DMSO trong quá trình rửa
2. Rửa với tetrahydrofuran

7.5. Môi trường sắc ký tách protein theo cỡ (rây protein)

Có 2 quá trình rửa/tái sử dụng liên quan tới việc tách loại tạp chất từ môi trường phân tích theo kích cỡ protein.

Protein giữ yếu: Rửa với  30 mL dung dịch đệm photphat, 0.1M, pH = 3

Protein giữ mạnh: Rửa trong vòng 60 phút bằng hỗn hợp dung dịch thay đổi nồng độ từ 100% nước tới 100% axetonitrile

7.6. Cacbon graphit xốp

Có 4 qui trình khác nhau để rửa/tái sử dụng cột tùy thuộc vào loại carbon graphite, việc áp dụng qui trình nào phụ thuộc vào chất phân tích, dung môi đã được dùng trước trên cột.

Tái sử dụng axit/bazo: phù hợp với các loại đã ion hóa phân tích trong môi trường pha ưa nước

1. Úp ngược cột
2. Rửa với 50ml dung dịch tetrahydrofuran/nước (tỷ lệ 1:1) chứa 0.1% axit trifloroaxetic với tốc độ 1ml/phút
3. Rửa với 50ml dung dịch tetrahydrofuran/nước (tỷ lệ 1:1) chứa 0.1% trietyl amin hoặc NaOH với tốc độ 1ml/phút
4. Rửa với 50ml dung dịch tetrahydrofuran/nước (tỷ lệ 1:1) chứa 0.1% axit trifloroaxetic với tốc độ 1ml/phút
5. Rửa với hỗn hợp methanol/nước (tỷ lệ 95:5) để tái cân bằng
6. Đảo lại cột

Tái sử dụng hợp chất hữu cơ mạnh: phù hợp với các ứng dụng liên quan tới các loại chất phân cực hoặc đã ion hóa trong môi trường pha nước.

1. Rửa với 50ml axeton với tốc độ 1ml/phút
2. Rửa với 120ml dietyl ete với tốc độ 1ml/phút
3. Rửa với 50ml axeton với tốc độ 1ml/phút
4. Rửa với pha động ưa nước tới khi cân bằng

Tái sử dụng pha thường: thích hợp với các ứng dụng chạy chủ yếu trong môi trường pha thường

1. Rửa với 50ml dichloromethane ở tốc độ 1ml/phút
2. Rửa với 50ml methanol với tốc độ 1ml/phút
3. Rửa với 50ml phút (tốc độ 1ml/phút)
4. Rửa với 50ml dung dịch HCl 0.1M (tốc độ 1ml/phút)
5. Rửa với 50ml phút (tốc độ 1ml/phút)
6. Rửa với 50ml methanol với tốc độ 1ml/phút
7. Rửa với 50ml dichloromethane ở tốc độ 1ml/phút
8. Rửa với pha động tới khi cân bằng

Loại bỏ axit Trifloro axetic: thích hợp với các ứng dụng dùng pha động có chứa axit trifloro axetic

Rửa cột với axeton nitril đã được gia nhiệt tới 75ºC, cột nên được giữ ở nhiệt độ này

VIII. Cách sắp xếp các đường ống, dây nối… của thiết bị

Một hệ thống HPLC có cấu tạo tốt sẽ giảm được tối thiểu thể tích chết giữa các bộ phận của nó và hạn chế việc rò rỉ.

Khi bị lỗi đường ống có thể biết qua nhiều dấu hiệu như phổ bị dãn rộng, nhiễu nền tăng…, phát hiện đường kính ống không chính xác thường rất khó khắc phục tại chỗ. Đường kính trong của ống được sử dụng trong hệ HPLC thay đổi theo vị trí trong thiết bị, để biết chính xác phải xem Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy.

Loại ống sử dụng được xác định nhờ vào ứng dụng sẽ thực hiện. Có 2 loại phổ biến nhất là bằng thép và PEEK™. Khi thay đổi ống, phải đảm bảo vật liệu ống tương thích với bất kì loại dung môi nào có thể được dùng (hoặc rửa).

Bảng 1: Các dung môi tương thích với ống bằng vật liệu polymer

Bảng 2: Các dung môi tương thích với ống nghiệm bằng PEEK ở nhiệt độ cao

Trong đó: 1- tương thích, không có tương tác phụ

2- tương thích tùy thuộc vào ứng dụng

3- Không tương thích / không nên dùng

IX. Khi phổ đo bị dãn rộng

Đỉnh sắc ký bị tù (doãng rộng) thường liên quan đến sự thay đổi của thời gian lưu, làm giải phổ bị dãn rộng. Thường xuất hiện trên cột HPLC, nhưng cũng có thể do hệ thống bơm mẫu và dung môi. Qui trình sau đây mô tả phương pháp kiểm tra độ dãn phổ do lỗi thiết bị HPLC. Ảnh hưởng cột phân tích có thể đo được bằng cách tính toán

1 – Tháo cột HPLC khỏi hệ thống và thay vào đó “zero dead volume union” – thiết bị cho thể tích chết bằng 0 (một cột nối trông giống cột sắc ký thường nhưng không tạo thể tích chết thay cho cột sắc ký)

http://www.vici.com/vfit/zdv.php

2 – Cài đặt cấu hình hệ HPLC theo các thông số sau:

                Tốc độ dòng: 1ml/phút

                Độ nhạy đầu dò: 0.5 tới 1.0 AUFS

                Thời gian đo không đổi của đầu dò: 2 phút hoặc nhỏ hơn

                Tốc độ sắc ký đồ (nếu cần): 20 cm/phút

3 – Thực hiện pha loãng gấp 10 lần dung dịch kiểm tra hiệu quả cột, tiêm vào hệ thống 5µl hỗn hợp này

4 – Điều chỉnh độ nhạy của đầu dò cho tới khi đỉnh sắc ký (peak) đạt tới 75% chiều cao peak khi đọc bình thường.

5 – Đo độ rộng của đỉnh sắc ký tại chiều cao bằng khoảng 4.4% chiều cao của peak (phương pháp đo hiệu suất cột 5-sigma)

6 – Chuyển đổi từ độ rộng của đỉnh sắc ký sang thành ml theo công thức:

Độ rộng của phổ (µl) = độ rộng của phổ đo được x (1/20) x 1 x 1000

Trong đó: Độ rộng của phổ đo được là chiều rộng đo được tại chiều cao 4.4% chiều cao của peak (cm); (1/20) thể hiện tốc độ của sắc ký đồ (phút/cm);              1 là tốc độ dòng (ml/phút); 1000 thể hiện cho hệ số hiệu chỉnh thể tích (µl/phút)

Lưu ý: giá trị độ dãn phổ thường là khoảng  100 mL ± 30 μL. Nếu giá trị quá lớn so với giá trị này có thể do sai số ở các bộ phận khác của thiết bị: đầu dò, van bơm mẫu, các đường ống, mối nối…

Cần phải đảm bảo hệ thống HPLC của bạn không tạo thêm các thể tích chết vì nó sẽ làm tăng cao độ rộng của phổ.

7 – Khi giá trị độ dãn phổ cao, phải khắc phục sai số của hệ thống HPLC rồi lại lặp lại các quá trình trên. Nếu như giá trị giảm xuống tới mức chấp nhận được, thì vấn đề đã được giải quyết. Nếu chỉ giảm một phần thì cần phải tìm thêm các nguyên nhân khác.

Nếu vấn đề vẫn không thể giải quyết, cần liên hệ với đơn vị cung cấp thiết bị để kiểm tra, bảo trì.

Bảng dưới liệt kê chi tiết giá trị thể tích dung môi trên chiều dài trong đường ống với các kích thước khác nhau.

X. Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu không chỉ đơn thuần là làm tan mẫu rắn vào chất lỏng mà nó còn cần nhiều các công đoạn khác như lọc, chiết, tạo dẫn xuất cũng như đo khối lượng hay nồng độ.

Các mẫu cần phải lọc nếu như trong mẫu có chứa huyền phù (các hạt rắn). Có thể thực hiện on-line bằng bộ tiền lọc trước cột hoặc khi đưa mẫu vào trong các lọ.

Các mâu cần chiết thường có chứa chất phân tích ở nồng độ nhỏ. Phương pháp phổ biến nhất là phương pháp chiết lỏng-lỏng, rắn-lỏng và chiết pha rắn. Phương pháp cuối được xem là đơn giản nhất và dễ làm nhất. Câu hỏi thường được đưa ra là Khi nào thì thực hiện chiết mẫu?

Câu trả lời đơn giản là:

- Khi chất nền – là chất chứa trong quá trình phân tích, là yếu tố gây nên nhiễu hệ thống HPLC hoặc gây tắc thiết bị do các hạt vật chất hoặc

- Khi chất phân tích ở nồng độ quá thấp cần quá trình tinh chế mẫu. Chiết pha rắn không khó để thực hiện và cần rất ít các thiết bị chuyên dụng.

Quá trình tạo dẫn xuất có thể thực hiện trước hoặc sau cột, thực hiện thủ công hoặc tự động. Thông thường cần dùng do yêu cầu của đầu dò, ví dụ: các phân tích dùng đầu dò UV không phát hiện các nhóm mang màu. Có rất nhiều kỹ thuật tạo dẫn xuất, phải kiểm tra kỹ để chọn phương pháp phù hợp cho từng ứng dụng để tránh tạo ra các sản phẩm phụ gây nhiễu sắc ký đồ trong quá trình phân tích tiếp theo.

XI. Lưu ý khi kết nối LC với đầu dò khối phổ MS

Một máy khối phổ tốt đến mấy cũng không thể bù lại được một hệ thống sắc ký lỏng kém hiệu quả. Vì vậy, khi cần một hệ LCMS cần phải xem xét kỹ cả máy LC.

1. Lựa chọn các loại dung môi HPLC grade phù hợp
2. Tránh dùng các hỗn hợp dung môi lạ. Hệ dung môi thường dùng cho hầu hết các hệ LCMS là: MeOH, acetonitrile, nước và axit formic 0.1%
3. Hòa tan mẫu trong dung môi pha động khi bắt đầu (dung môi yếu nhất có thể).
4. Các dung môi khác:

Isopropanol, có thể dùng cho cả pha thường và pha đảo

Dichloromethane, chloroform, hexane chop ha thường khi máy khối phổ dùng bộ ion hóa APLCI

5. Các dung dịch đệm dễ bay hơi cho hệ LCMS:

Dung dịch đệm	pKa	Dải pH
Format	3.8	2.8 - 4.8
Acetat	4.8	3.8 - 5.8
Carbonat	6.4 10.3	5.4 - 7.4 9.3 - 11.3
Ammonia	9.2	8.2 - 10.2
Diethylamine	10.5	9.5 - 11.5
Triethylamine	11	10 – 12

- Có thể dùng muối ammoni

- Nồng độ: 10mM (có thể tới 50mM khi dùng cho máy APCI)

Axit Formic, acetic 0.01 – 1% v/v

Axit Trifluoroacetic  < 0.1% v/v

Các Alkylamine có tính bazo < 0.1% v/v

- Không dùng các muối carbonat

6. Tóm tắt:

Dùng được: các dung dịch đệm có bay hơi; nồng độ dung dịch đệm thấp, dung dịch có tỷ lệ hữu cơ-nước cao, axit axetic, axit formic

Không dùng: Các dung dịch đệm không bay hơi, axit vô cơ, nồng độ dung dịch đệm cao, dung dịch đệm có hàm lượng nước cao, TFA > 0.1%

(Hết)

Nguồn: Université de neuchâtel

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam