Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Kỹ thuật lai tại chỗ (In situ hybridization ISH)

BioMedia

Lai tại chỗ (In situ hybridization- ISH) là phương pháp lai sử dụng một đoạn ADN, ARN bổ sung hoặc một đoạn axit nucleic đã biến đổi (gọi là đầu dò) để xác định vị trí của một trình tự ADN hay ARN nhất định trên một phần mẫu mô (tại chỗ), hoặc với kích thước mẫu nhỏ như hạt cây, phôi ruồi giấm Drosophila thì tiến hành lai trên toàn bộ mẫu nguyên vẹn (Lai tại chỗ toàn bộ) ở tế bào thường và các tế bào khối u tuần hoàn di căn (circulating tumor cells – CTCs). Lai tại chỗ khác với nhuộm miễn dịch huỳnh quang, phương pháp nhuộm miễn dịch thường dùng để xác định vị trí của protein trên mẫu mô.

Lai tại chỗ là một kỹ thuật hiệu quả để xác định các loại mARN nhất định trong từng tế bào của các mẫu mô, nhằm tìm hiểu các quá trình sinh lý và phát sinh bệnh. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều bước, cần tối ưu hóa cho từng loại mô và cho mỗi loại đầu dò sử dụng. Để có thể giữ mARN đích trong các mô, người ta thường sử dụng các chất cố định liên kết chéo (ví dụ như formaldehyde).

Nguồn ảnh: http://www.veritastk.co.jp/

Lai tại chỗ thường được sử dụng để phát hiện vị trí của các trình tự axit nucleic nhất định trên nhiễm sắc thể hoặc mô, đây là kỹ thuật rất quan trọng giúp hiểu cấu trúc sắp xếp, quá trình điều hòa và chức năng của các gen. Các kỹ thuật cơ bản quan trọng hiện nay được sử dụng gồm: lai tại chỗ giữa mARN với các đầu dò ARN hoặc các đoạn nucleotide ngắn (cả hai đều được đánh dấu phóng xạ và đánh dấu hapten); phân tích dưới kính hiển vi quang học và điển tử; lai tại chỗ trên toàn bộ mẫu; phát hiện cả ARN và ARN liên kết với protein; và lai huỳnh quang tại chỗ để dò tìm các trình tự nhiễm sắc thể. Lai tại chỗ ADN có thể được sử dụng để xác định cấu trúc của nhiễm sắc thể. Ví dụ như lai huỳnh quang tại chỗ ADN được sử dụng để đo lường và xác định vị trí các loại ARNs (ARNs thông tin, lncARNs_ ARN dài không mã hóa, và miARNs) trên tế bào, trên mẫu mô một phần, mẫu nguyên vẹn và các tế bào khối u tuần hoàn di căn (CTCs). Phương pháp lai tại chỗ được phát minh bởi Joseph G. Gall.

Lai huỳnh quang tại chỗ

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật nghiên cứu di truyền tế bào sử dụng các đầu dò huỳnh quang gắn vào các trình tự bổ sung trên nhiễm sắc thể. Phương pháp này được các nhà nghiên cứu sinh y phát triển vào đầu những năm 1980 và được dùng để dò tìm vị trí và xác định sự có mặt của các trình tự ADN nhất định trên nhiễm sắc thể. Kính hiển vi huỳnh quang có thể được sử dụng để tìm ra vị trí tại đó đầu dò huỳnh quang gắn vào các nhiễm sắc thể. Lai FISH thường được sử dụng để tìm các điểm đặc biệt trong ADN, được ứng dụng trong tư vấn di truyền, y học và xác định loài. Lai FISH cũng có thể được sử dụng để phát hiện và xác định vị trí các ARN đích đặc hiệu (ARNs thông tin, lncARNs và microARNs) bên trong tế bào, tế bào khối u tuần hoàn di căn và các mẫu mô. Trong trường hợp này, lai FISH giúp xác định sự biểu hiện gen (trong tế bào và mô nhất định ở những khoảng thời gian khác nhau trong quá trình phát triển).
FISH

Nguồn ảnh: http://www.abnova.com/

Đầu dò – ARN và ADN

Đầu dò ARN có thể được thiết kế cho bất kỳ gen nào hay một đoạn trình tự nào trong gen để phát hiện mARN, lncARN và miARN trong các mô và tế bào. Nguyên tắc của lai FISH là xem xét chu trình nhân lên của tế bào, đặc biệt ở pha trung gian của nhân tế bào để tìm các bất thường trong nhiễm sắc thể. Việc lai giữa đầu dò và đoạn nucleic trong tế bào tạo ra tín hiệu giúp phát hiện các bất thường. Mỗi đầu dò để xác định mARN và lncARN gồm 20 cặp oligonucleotide, mỗi đoạn có độ dài khoảng 40–50 bp (basepair = cặp bazơ). Đối với việc phát hiện miARN, các đầu dò sử dụng tính đặc hiệu hóa học để phát hiện các miARN và các đầu dò này bổ sung toàn bộ trình tự miARN.

Các đầu dò thường là các đoạn ADN tách chiết, tinh sạch và khuếch đại cho việc sử dụng trong Dự án giải mã hệ gen người. Để bảo tồn các đoạn trình tự ADN riêng biệt này, chúng được cài vào hệ thống quần thể vi khuẩn và được nhân lên liên tục. Tách dòng các quần thể vi khuẩn, mỗi quần thể sẽ lưu trữ một nhiễm sắc thể nhân tạo đơn lẻ, được bảo quản tại nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Các nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC) có thể sinh trưởng, tách chiết và đánh dấu trong bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Các đọan này có trình tự tới 100 nghìn cặp bazơ và là nền tảng tạo ra hầu hết các đầu dò cho lai FISH.

Các ứng dụng y học

Thông thường ba mẹ của những đứa trẻ mắc những khuyết tật về sự phát triển muốn biết nhiều hơn về tình trạng của con họ trước khi lựa chọn có thêm đứa con nữa. Nỗi lo lắng này có thể được giải quyết bằng phân tích ADN của bố mẹ và đứa con. Trong trường hợp khuyết tật của đứa con chưa được hiểu rõ ràng, nguyên nhân gây khuyết tật có thể được xác định được khi sử dụng kỹ thuật lai FISH và các kỹ thuật nghiên cứu di truyền tế bào.

Trong y học, FISH có thể được sử dụng để chẩn đoán, đánh giá tiên lượng, hoặc đánh giá sự tái phát của một bệnh, ví dụ như ung thư. FISH cũng có thể được sử dụng để tìm kiếm các tế bào bị bệnh dễ hơn so với các phương pháp di truyền tế bào khác, vì các phương pháp đó thường đòi hỏi các tế bào đang ở pha phân chia, đòi hỏi thời gian, các bước chuẩn bị thủ công tốn thời gian, sức lực và kinh nghiệm của kỹ thuật viên khi phân tích tiêu bản. Ngược lại, phương pháp lai FISH không cần đòi hỏi tế bào sống và có thể đánh giá định lượng một cách tự động, máy tính có thể đếm các điểm huỳnh quang. Tuy nhiên, kỹ thuật viên yêu cầu phải được đào tạo mới có thể phân biệt được sự khác biệt nhỏ giữa các kiểu sắp xếp của các băng trên các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa khi chúng bị bẻ cong hay xoắn lại. Kỹ thuật lai FISH có thể được tích hợp thành thiết bị vi lỏng “Lab-on-a-chip”.

Xác định loài

Lai FISH thường được sử dụng trong các nghiên cứu lâm sàng. Nếu một bệnh nhân bị nhiễm một tác nhân gây bệnh, vi khuẩn từ mô hoặc dịch của bệnh nhân thường được nuôi trên thạch agar để xác định chủng loại của tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, nhiều chủng vi khuẩn, thậm chí là những chủng loài đã biết rõ lại không thể sinh trưởng tốt trong điều kiện phòng thí nghiệm. Lai FISH có thể được sử dụng trong trường hợp này để trực tiếp phát hiện sự có mặt của tác nhân nghi ngờ gây bệnh trên các mẫu mô của bệnh nhân.

FISH cũng có thể được sử dụng để so sánh hệ gen của hai loài sinh học nhằm tìm ra mối quan hệ tiến hóa. Đầu dò lai FISH vi khuẩn thường là các đoạn mồi cho vùng 16s ARN ribosome.

FISH được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sinh thái học vi sinh, để xác định các loài vi sinh vật. Ví dụ như màng sinh học (biofilm) thường được cấu thành từ phức hệ tổ chức đa loài vi khuẩn. Việc tạo đầu dò cho một loài vi khuẩn và thực hiện lai FISH với đầu dò này cho phép quan sát sự phân bố của loài này trên màng sinh học. Việc tạo các đầu dò (hai màu khác nhau) cho hai loài vi khuẩn cho phép quan sát vị trí của hai loài trên màng sinh học và có thể hữu ích trong việc xác định kết cấu ổn định của màng sinh học.

Kiểu nhân số hóa thực

Kiểu nhân số hóa thực là một phương pháp thay thế lâm sàng và ít tốn kém bởi sử dụng tấm lai huỳnh quang tại chỗ (FISH panels) và hàng ngàn tới hàng triệu đầu dò trên một dãy đơn lẻ để phát hiện những thay đổi về số bản sao trên toàn bộ hệ gen ở độ phân giải rất cao.

Kiểu nhân quang phổ

Kiểu nhân quang phổ là một phương pháp mà trong đó các nhiễm sắc thể được đánh dấu màu khác nhau. Kiểu nhân quang phổ liên quan đến kỹ thuật lai FISH sử dụng các dạng khác nhau của nhiều loại đầu dò cho kết quả quan sát được mỗi nhiễm sắc thể ở kỳ giữa. Loại kiểu nhân này được sử dụng đặc biệt để phát hiện sự tái sắp xếp các đoạn nhiễm sắc thể.

Dịch và tổng hợp từ Wikipedia

BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

Kỹ thuật lai tại chỗ (In situ hybridization ISH)

Lai tại chỗ (In situ hybridization- ISH) là phương pháp lai sử dụng một đoạn ADN, ARN bổ sung hoặc một đoạn axit nucleic đã biến đổi...

Kháng thể (Phần 1)

Xem bài: Kháng thể (Phần 2) tại đây Kháng thể (Antibody-AB), còn được biết như là globulin miễn dịch (immunoglobulin-Ig), là protein lớn, có hình chữ Y được tạo ra...

Nuôi cấy mô tế bào thực vật

1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử...

Phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry)

Phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry) Trong công nghệ sinh học, phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật...