Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Kỹ thuật PCR (Phần 1)

BioMedia

Xem bài: Kỹ thuật PCR (Phần 2) tại đây

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó.

Được phát triển năm 1983 bởi Kary Mullis, PCR là một kỹ thuật phố biến và không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học với nhiều ứng dụng khác nhau như nhân bản ADN để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựa trên bằng chứng về ADN, hoặc phân tích chức năng của gen; chẩn đoán các bệnh di truyền; xác định các dấu vân tay ADN (sử dụng trong khoa học pháp y và xác định quan hệ huyết thống ); phát hiện và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm. Năm 1993, Mullis được trao giải thưởng Nobel Hóa học cùng với Michael Smith cho nghiên cứu của mình về PCR.

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính ADN và tái bản ADN. Đoạn mồi (là đoạn ADN ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự ADN đích và ADN polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, ADN mới được tạo ra từ ADN khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi  phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân.

Hầu như tất cả các kỹ thuật PCR sử dụng một ADN polymerase bền nhiệt, như Taq polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus). ADN polymerase này có hoạt tính lắp ráp tổng hợp sợi ADN mới từ các đơn phân nucleotide bằng cách sử dụng khuôn ADN sợi đơn và các đoạn ADN oligonucleotide ( hay còn gọi là ADN mồi), đây cũng là các thành phần bắt buộc để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA. Phần lớn các phương pháp PCR sử dụng chu trình nhiệt, nghĩa là, tiến hành xen kẽ quá trình gia nhiệt và giảm nhiệt các mẫu PCR thông qua một chuỗi các giai đoạn nhiệt khác nhau được xác định.

Ở bước đầu tiên, hai sợi xoắn kép của ADN được tách ra ở nhiệt độ cao, quá trình được gọi là quá trình biến tính ADN. Ở bước thứ hai, nhiệt độ được hạ xuống và hai sợi ADN trở thành khuôn cho ADN polymerase tổng hợp đoạn ADN đích. Khả năng khuếch đại chọn lọc là do việc sử dụng mồi mang trình tự bổ sung với đoạn ADN đích khuếch đại dưới những chu trình nhiệt đặc hiệu.

Quy trình

Nguồn ảnh: GraphicE.Schimd/2003

Thông thường, PCR bao gồm một chuỗi khoảng 20-40 lần biến đổi nhiệt độ lặp đi lặp lại, gọi chu kỳ, mỗi chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường là ba. Các chu kỳ thường bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C), và sẽ dừng lại khi sản phẩm cuối cùng được tổng hợp hoặc dừng lại ở nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR trong thời ngắn. Nhiệt độ và thời gian thực hiện của mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Những yếu tố này gồm enzyme tổng hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong phản ứng, và nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi.

  • Giai đoạn khởi đầu(Chỉ cần đối với những enzyme ADN polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ). Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C nếu sử dụng polymerases cực kỳ bền nhiệt) và được tiến hành trong 1-9 phút.
  • Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt độ lên 94-98°C trong 20-30 giây. ADN được biến tính bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa các bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn.
  • Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để mồi gắn vào sợi ADN đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi ADN, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá cao, mồi có thể không gắn. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Liên kết hydro bền giữa phân tử ADN- ADN chỉ được hình thành khi mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn. Polymerase liên kết với các phân tử lai ADN mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp ADN.
  • Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các ADN polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C , và nhiệt độ 72°C thường được sử dụng với enzyme này. Tại giai đoạn này ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với ADN khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5′ – phosphate của dNTP với nhóm 3′ – hydroxyl phía cuối của sợi ADN vừa mới được hình thành. Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. Thông thường, các ADN polymerase có khả năng khuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút. Trong điều kiện tối ưu, tức là, nếu không có hạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lượng ADN được khuếch đại sau mỗi chu kì tuần theo hàm mũ.
  • Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt độ 70-74 °C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trong phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả ADN sợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn.
  • Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng.

Xem bài: Kỹ thuật PCR (Phần 2) tại đây

Dịch và tổng hợp từ WIKIPEDIA

BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

Kỹ thuật PCR (Phần 1)

Xem bài: Kỹ thuật PCR (Phần 2) tại đây Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để...