Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Điện di trường xung đẩy

BioMedia

1. Giới thiệu

Có rất nhiều phương pháp điện di hiệu quả được tạo ra tùy thuộc vào khả năng của chúng để phân tách quan sát phân tử ADN trong lĩnh vực sinh học phân tử hiện nay. Trong đó kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất là điện di gel agarose chuẩn. Điện di trên gel là một trong những kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi nhất trong phòng thí nghiệm sinh học hiện đại bởi vì sự đơn giản và linh hoạt của nó. Điện di được sử dụng rộng rãi trong việc làm sạch và phân tách các protein và acid nucleic. Bản đồ vật lý của gen và sự sắp xếp chuỗi ADN đều phụ thuộc vào sự phân tách của điện di trên gel. Điện di trên gel các phân tử ADN thường được thực hiện bằng cách đặt ADN trong một chất nền rắn (ví dụ agarose hoặc polyacrylamide) và các phân tử được đi qua gel dưới tác dụng của dòng điện. Các ADN kích thước từ 100, 200 bp tới 50 000 bp (50 kb) được phân tách bằng kỹ thuật điện di thông thường, đối với ADN kích thước trên 50 000 bp, sự phân tách trên gel bị mất đi do kích thước lớn của phân tử, các đoạn ADN mở rộng ra và có độ linh động cao khác thường. Mặc dù các đoạn lớn hơn (lên tới 750 kb) vẫn được xử lý bằng kỹ thuật này cùng với loại gel cực mỏng do nồng độ rất thấp của agarose nhưng sự phân tách không thích hợp cho hầu hết mọi ứng dụng. Sự phân tách của phân tử ADN bằng các kỹ thuật khác rất tốn thời gian. Sự cần thiết của việc phân tích các phân tử ADN lớn là trong việc lập bản đồ diện rộng.

dien di truong xung

Năm 1982, Sdhwartx et al đã cho rằng phân tử ADN lớn hơn 50 kb có thể được phân tách bằng cách sử dụng 2 trường điện từ khác khau (ví dụ PFGE). Các thiết bị dựa trên nguyên lý này đã được phát triển kể từ khi đó, trường xung đã được sử dụng để phân tách ADN từ vài kb tới 10 mega base (Mb).

Sự phát triển của PFGE được thúc đẩy do yêu cầu về kích thước phân tử ADN có thể được phân đoạn và phân tách. Hướng phát triển này có vai trò quan trọng trong sinh học phân tử vì nó làm đơn giản đi rất nhiều các phân tích tốn thời gian trước đó và tạo khả năng để làm những cái mới hơn. Phạm vi ứng dụng của nó bao gồm tất cả sinh vật từ vi khuẩn và virus tới động vật có vú. PFGE có khả năng xuất sắc trong việc chia nhỏ, tuyến tính hóa tự nhiên các nhiễm sắc thể ADN khác nhau với kích thước từ 50 kb nhiễm sắc thể vi mô của ký sinh trùng tới hàng triệu bp nhiễm sắc thể nấm mem. Tuy nhiên nhiễm sắc thể của con người còn nguyên vẹn có kích thước từ 50 triệu đến 250 triệu bp (Mb) quá lớn đển phân tách trực tiếp bằng PEGE. PFGE cung cấp phương tiện cho sự phân tách các đoạn ADN vượt quá 6000 kb, do đó PFGE có thể phân tách các ADN từ vài kb đến trên 10 Mb.

Ưu điểm của kỹ thuật PFGE là phân tử ADN cỡ lớn trong gel agarose dưới từ trường hữu hạn có cấu hình kéo dài và được định hướng, một điểm quan trọng nữa là có thể dễ dàng đo đạc kích thước bộ gen đây là một tham số có những sai số đáng kể khi đo đạc bằng các phương pháp khác trước đây. Một kết quả quan trọng của việc sử dụng PFGE và ngăn chặn sự tiêu hóa endonucleaza là xây dựng được bản đồ vật lý gen. Ứng dụng tổng quát của PFGE có thể thấy trong sự phân tách của toàn bộ nhiễm sắc thể, lập bản đồ giới hạn cỡ lớn của khu vực nhiễm sắc thể và sử dụng để tách lọc đoạn ADN cho việc nhân bản, và nó cho phép phân tích nhanh chóng cho một vùng nhiễm sắc thể rộng lớn. PFGE thực sự hữu dụng trong phép phân tích phân tử ADN từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm cả các đoạn gen đặc biệt của vi khuẩn, động vật có vú, ký sinh trùng protozoa và nhiễm sắc thể ADN nguyên vẹn từ nấm. Sự ra đời của kỹ thuật PFGE đã tiếp sức cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể ADN, cấu trúc gen và lý thuyết điện di.

2. Các loại PFGE

PFGE có thể đo đạc phân tử ADN có chiều dài cỡ milimet thông qua việc sử dụng xung điện trường, xung điện trường có thể điều chỉnh một cách chọn lọc độ linh động của phân tử. Hiệu ứng điện di trường xung đã được sử dụng trong nhiều thiết bị khác nhau (FIGE, TAFE, CHEF, OFAGE, PACE và thiết bị điện cực quay) để tăng cường độ phân giải của phân tử ADN có kích thước lớn và nhỏ. Vấn đề quan trọng khi lựa chọn hệ thống PFGE là đánh giá chi phí và hiệu suất sử dụng dự kiếm. Các loại khác nhau của PFGE là:

  • Điện di gel trong trường đảo (FIGE):

Năm 1986, Carle, Frank và Olson đã phát triển một hệ thống FIGE đơn giản, trong đó hai trường điện từ có hướng ngược nhau 180°, điện cực sẽ được đảo sau 1 khoảng thời gian với thời gian của xung thuận lớn hơn xung ngược để tạo ra đường di chuyển thuận. Đường di chuyển thuận có được bằng cách tăng tỷ số thời gian xung thuận với xung ngượctới khoảng 3:1. Để cải thiện độ phân giản, thời gian của xung được tăng dần sau mỗi lần chạy cái này được gọi là chuyển mạch thời gian (switch time ramping). Bằng cách thay đổi thời gian một cách liên tục trong quá trình thí nghiệm nên thiết bị FIGE có ưu điểm là thiết bị làn chạy thẳng và đơn giản, chỉ cần đến các hộp gel chuẩn và một bộ điều khiển xung. Ngày nay, FIGE được sử dụng rộng rãi cho sự phân tách đoạn ADN nhỏ, FIGE cũng cho kết quả chấp nhận được đối với đoạn ADN lên tới 800 kb (600-750 kb).

  • Điện di gel trong trường xem kẽ ngang (TAFE):

Đây là một dạng của PFGE cho phép phân tách các đoạn ADN lớn với định dạng đơn giản, thuận tiện mà không chịu các hạn chế của kỹ thuật trước đó. Trong TAFE gel được định hướng theo chiều dọc và 4 điện cực không nằm trong mặt phẳng của gel mà được đặt ở đằng trước và sau nó. Phân tử trong mẫu bị ép đi zíc zắc qua bề dày lớp gel và tất cả các làn có hiệu ứng tương tự nhau làm cho các băng vẫn là đường thẳng. Khi các phân tử di chuyển vào trong gel chúng bị biến đổi liên tục trong trường điện từ và góc định hướng, sự biến đổi ở tất cả các luồng là như nhau. Tuy nhiên góc giữa trường điện từ thay đổi từ mặt trên (115o) tới mặt dưới của gel (khoảng 165o) do đó các phân tử bị thay đổi vận tốc khi đi dọc theo bề dày lớp gel. Công nghệ TAFE với sự phân tách rõ nét của băng ADN có ưu điểm đặc biệt trong việc nghiên cứu di truyền học của nhiều đơn bào gây bệnh, việc mà các phân tích khác trước đó không thể làm được. TAFE được sử dụng trong việc phân tách đoạn ADN lên tới 1600 kb.

  •  Trường điện từ đồng nhất bằng cách chốt đường viền (CHEF):

CHEF là thiết bị được sử dụng rộng rãi nhất. Thiết bị CHEF cung cấp giải pháp tốt hơn cho hiệu ứng méo từ trường ở rìa và các cực điện thụ động. CHEF có 24 điện cực điểm bằng nhau và được đặt xung quanh đường viền hình lục giác. Trong hệ thống CHEF không có điện cực thụ động, tất cả các điện cực được kết nối với nguồn thông qua một vòng điện trở có cùng giá trị. Vòng điện trở này có tác dụng phân áp cho các điện cực xung quanh viền lục giác với các giá trị thích hợp để tạo ra một trường đồng nhất trong mỗi vị trí chuyển đồi luân phiên. Hệ thống CHEF thiết lập điện áp cho 24 điểm. Thiết bị này tạo ra một điện trường đồng nhất để sao cho tất cả các làn của gel đều chạy thẳng. CHEF sử dụng góc tái định hướng 120o với sự phát xạ của thế điện cực phát ra từ cực dương tới cực âm. CHEF có thể phân tách phân tử với số cặp lên tới 7000 kb.

  • Điện di gel trong trường xoay chiều trực giao (OFAGE):

Một thiết bị tương tự sử dụng hai trường điện từ không đồng nhất đã được Carle và Olson giới thiệu và năm 1984. Những nhược điểm chính của thiết bị này là điện trường không đồng nhất và góc của điện trường bị thay đổi khi đi qua gel nên phân tử ADN sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào vị trí của nó trong gel. Điều này cực kì gây bất lợi khi lập bản đồ gen của động vật có vú với phân bố liên tục của kích thước các đoạn ADN được tạo ra. Góc của trường điện từ thay đồi từ giá trị lớn hơn 90° tới giá trị nhỏ hơn 180°. Phân tử ADN từ 1000 tới 2000 kb có thể được phân tách bởi phương pháp này.

  • Điện di trên gal quay (RGE):

Năm 1987 tại Anh, Southerm đã mô tả một hệ thống PFGE mới lạ trong đó gel được quay giữa hai góc định trước trong khi điện cực bị ngắt. Hệ thống RGE có điện trường đồng dạng và các băng thẳng bởi vì luôn luôn chỉ có một bộ điện cực được sử dụng. RGE có thể điều chỉnh sự tăng của thời gian và điện áp một cách dễ dàng, nó cũng cho phép người dùng nghiên cứu sự ảnh hưởng của các góc khác nhau thậm chí có thể điều chỉnh các giá trị này trong thí nghiệm điều chỉnh góc. RGE sử dụng trường điện từ đơn, đồng nhất và thay đổi sự định hướng của trường điện từ đối với gel bằng cách quay gel một cách không liên tục theo chu kỳ. Các phân tử ADN di chuyển theo một đường thẳng dưới tác dụng của trường điện từ đồng nhất và các phân từ ADN từ 50 kb đến 6000 kb có thể được phân tách bằng cách điều chỉnh tần số quay của gel. Ngoài ra góc tái định hướng cũng có thể được thay đổi dễ dàng bằng cách thay đổi góc quay.

  • Điều khiển điện cực tự khả trình (PACE):

Hệ thống điện di PACE cho phép điều khiển chính xác tất cả các thông số của trường điện từ bằng cách điều chỉnh độc lập điện áp của 24 điện cực được xếp theo một đường viền kín. Sự linh hoạt của hệ thống PACE giúp nó tạo ra khả năng kiểm soát sự đồng nhất, độ chênh điện áp, sự định hướng và thời gian của điện trường một cách không giới hạn.  Hệ thống PACE có đầy đủ chức năng của các hệ trước đó, nó thể phân tách đoạn ADN từ 100 bp đến tận 6 Mb. Khả năng thay đổi góc tái định hướng giữa các trường xen kẽ của PACE cho phép tăng tốc quá trình phân tách của các phân tử ADN cỡ lớn. PACE là một công cụ cực kỳ hữu ích cho việc nghiên cứu sự ảnh hưởng tới sự di chuyển của ADN trong PFGE bởi các yếu tố như thời gian xung, nhiệt độ, nồng độ agarose điện áp và góc của trường điện từ.

  • Điện di trên gel trong trường xung đồng nhất trực giao (PHOGE):

Sự khác biệt cơ bản giữa thiết bị này với các thiết bị khác sử dụng điện trường đồng nhất là PHOGE sử dụng góc tái định hướng bằng 90° nhưng các phân tử ADN sẽ trải qua 4 chu kỳ tái định hướng thay vì 2 chu kỳ như trước, làn ADN lúc này sẽ ko chạy thẳng nữa do tác động của nhiều trường điện từ. Hệ thống có thể phân tách đoạn ADN lên tới 1 Mb.

3. Thiết bị PFGE

Thành phần cơ bản của hệ thống PFGE bao gồm hộp gel với một số phương tiện để điều chỉnh nhiệt độ, một bộ chuyển đổi cho việc điều khiển trường điện từ, hệ thống làm mát và nguồn nuôi.

  • Hộp gel

Hộp gel của PFGE bao gồm một loại gel cố định trong mảng các điện cực và phương tiện lưu thông bộ đệm điện di. PFGE thường sử dụng chênh áp 10 V/cm, chênh áp lớn hơn 15 V/cm được sử dụng trong trường phân tách nghịch đảo của các véc tơ cosmid vô tính. Nhiệt độ của bộ đệm được điều khiển bởi cơ cấu gia nhiệt, thông thường bộ đệm được lưu thông qua hộp gel bằng cách sử dụng các cổng vào ra.

  • Nguồn nuôi cao áp

Điều kiện cần thiết để thu được sự phân tách phù hợp trong PFGE là phải điều khiển được chênh áp. Chất lượng đầu ra của bộ nguồn phải đủ cao để đáp ứng điều kiện về cả điện áp và dòng điện của hộp gel. Hộp gel PFGE thông thường có các điện cực cách nhau 25-50 cm, để thu được chênh áp trong khoảng 1.5 đến 15 V/cm thì điện áp tối đa của nguồn nuôi phải cỡ 750V, dòng điện thu được với mức điện áp này trong hầu hết mọi hộp gel là vào khoảng 0.5A ở 14°C sử dụng bộ đệm là 0.5x TBE (1x TBE gồm 89mM Tris PH=7, 89mM a xít Boric và 2 mM EDTA).

  • Khối đóng ngắt

Khả năng kiểm soát thời gian đóng ngắt là rất quan trọng đối với sự phân tách, tốc độ đóng ngắt giới hạn của các rơle sẽ không tương thích với việc phân tách các phân tử ADN nhỏ (5-5 kb). Các rơle thông thường được điều khiển bằng máy tính, để khắc phục nhược điểm của các rơle điện cơ ngày nay trong các hệ thông PFGE thương mại chúng đã được thay thế bằng các rơle điện tử điện áp cao. Các loại rơle điện tử này được chế tạo dựa trên transistor hiệu ứng trường ôxít kim loại bán dẫn (MOSFETs) được sử dụng trong mạch đóng ngắn điện cực và điều khiển điện áp, chúng cải thiện độ tin cậy, khả năng đóng ngắt tốc độ cao (0.1 mS), cho điện áp (750V) và dòng ra (0.5A) có chất hượng cao. Những thiết bị này có khả năng điều khiển góc tái định hướng của trường điện từ, tuy nhiên cũng không đủ nhanh để cải thiện sự phân tách của các phân tử ADN nhỏ hơn 50 kb.

  • Chương trình máy tính

Kiểm soát chặt chẽ khoảng thời gian đóng ngắt là rất quan trọng trong việc kiểm soát độ phân giải trong PFGE. Một bố đóng ngắt linh hoạt nên được trang bị phần mềm với các tính chất giống nhau. Thuật toán điều khiển phải đủ nhanh để thời gian đóng ngắt tối thiểu phải ngắn cỡ 1ms và gia số thời gian đóng ngắt phải có độ phân giải ít nhất là 1ms. Thông thường các bộ đóng ngắt tuyến tính hay được sử dụng vì hoạt động đơn giản của nó. Thời gian phân tích tối đa nên chọn lên tới khoảng 2 tuần để có thể phân tách đối với các ADN rất lớn và được điều khiển bằng phần mềm máy tính.

  • Bộ làm mát

Quá trình tuần hoàn của bộ đệm là một nhân tố quan trọng, nó giúp loại bỏ sự biến thiên nhiệt độ trong gel làm giảm bớt quá trình phá hỏng bộ đệm khi điện phân. Sự di chuyển của các phân tử ADN phụ thuộc rất mạnh vào nhiệt độ do đó phải duy trì sự đồng nhất của nhiệt đô trong gel để đảm bảo cho quá trình di chuyển trong mỗi làn. Bộ đệm được tuần hoàn qua buồng gel thông qua một bơm điện từ với tốc độ 450 ml/phút. Bộ đệm được làm lạnh trong một bình nước tuần hoàn với nhiệt độ 5°C do đó nhiệt độ của bộ đệm luôn được duy trì ở mức 13-15°C trong suốt quá trình hoạt động.

 Dịch và tổng hợp BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

Điện di trường xung đẩy

1. Giới thiệu Có rất nhiều phương pháp điện di hiệu quả được tạo ra tùy thuộc vào khả năng của chúng để phân tách quan sát...